熒光定量PCR儀校準方法與結果情況

實時熒光定量PCR儀特異性更強，自動化程度更高，且有效地解決了PCR污染的問題，應用領域及應用量都不斷增加。但其設計更為復雜，溫度模塊和光學系統(tǒng)設計同時影響其性能和實驗準確性，為定量PCR儀校準帶來了巨大挑戰(zhàn)。采用生物試劑等方式對定量PCR儀熒光部分校準缺乏溯源性，無法分析誤差來源，存在較大缺陷。

PCR儀操作簡單、靈敏度高，被廣泛地應用于分子生物學中。但傳統(tǒng)PCR儀不能準確定量，操作過程中易污染使得假陽性率高等缺陷。熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。這一技術特異性更強，自動化程度更高，且有效地解決了PCR污染。

因此，實時熒光定量PCR儀逐步取代普通PCR儀在臨床檢驗、檢驗檢疫、法醫(yī)鑒定、疾病控制、體外診斷試劑制造和研發(fā)、生物技術產品研發(fā)等領域得到了更為廣泛的應用。熒光定量PCR儀在普通PCR儀的技術上增加了熒光激發(fā)裝置和檢測系統(tǒng)，包含激發(fā)光光源、濾光片、鏡頭和熒光檢測器等。檢測系統(tǒng)有超低溫ＣＣＤ成像系統(tǒng)和光電倍增管ＰＭＴ。

熒光定量PCR儀光學校準方法與結果分析的性能起到決定性控制作用，共同決定最終實驗結果的準確性和可靠性。因此，對定量PCR儀的校準需求也逐步從單純的溫場校準轉向溫度加熒光的復合參數校準。

１，熒光定量PCR儀校準現狀

相對于傳統(tǒng)PCR儀，熒光定量PCR儀的影響因素更為復雜，主要因素包含化學試劑、溫度模塊的溫度因數、頂蓋溫度因數、鏡頭、反光鏡和光路通道、熒光接收器的敏感度、機械組成部分、熒光信號處理軟件的閾值設定，如基線，基線設定，Ｓ／Ｎ比例探測等，這就為熒光定量PCR儀的校準帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

國內校準機構目前針對熒光定量PCR儀的校準主要分為兩種情況：

一種是僅對熒光定量PCR儀的溫場部分進行校準，這種方法無法對熒光定量PCR儀光學部分進行校準，所獲得的結果不能對熒光定量PCR儀的性能進行全面評估；

另外一種方法是利用化學試劑對熒光定量PCR儀的進行熒光檢測，這種方法同樣存在極大缺陷。首先采用化學方法對定量PCR儀熒光系統(tǒng)進行校準，無法溯源到任何*的標準，不具備溯源性。其次，梯度稀釋試劑的過程中由于人為操作會引入一定的誤差，誤差值可能較大，直接影響到最終的檢測結果。最重要的是，采用這種方法進行校準，無法說明熒光定量PCR儀的溫度和熒光對最終定量結果的影響關系，誤差多少及誤差來源等。

隨著定量PCR儀的應用越來越廣泛，使用者迫切需要對熒光定量PCR儀的性能進行評估。在現有檢測手段無法滿足需求的情況下，熒光定量PCR儀使用者普遍采用兩種方式自行對儀器狀態(tài)進行判斷，一種是使用生物試劑測試盤這種檢測方法和采用已知濃度的質粒ＤＮＡ標準物質對樣本線性誤差進行校準的方法都屬于化學方法，這種方法僅能夠針對孔與孔間的組合線性進行測量，所得結果僅能代表PCR儀孔與孔間的平均結果，不能代表單孔的線性，無法真實反映儀器的性能。另一種方法是采用多臺不同廠家或型號定量PCR儀實驗比對的方式來比較不同儀器間的系統(tǒng)誤差，判斷系統(tǒng)誤差是否在臨床接受范圍內。這種方法既不具備溯源性，又需要對單個項目進行實驗比對，成本較高。

影響定量PCR儀結果重復性的２個主要原因是邊緣效應和實驗誤差，而邊緣效應是由于光路設計缺陷和控溫模塊缺陷導致的。如果光路設計存在缺陷，會導致PCR儀樣品槽的邊緣孔和中間孔光程存在差異，不同反映孔間熒光基團獲得的激發(fā)光能量存在差異，最終影響實驗結果。同時，加熱模塊的空間溫差同樣會導致這種邊緣效應，研究表明，孔間溫差的微小差別可能在基因擴增的過程中被指數級放大，最終影響實驗結果。此外，光路設計缺陷和孔間溫差的存在還會直接影響到熔解曲線的結果，使得不同儀器對熔解曲線的分辨率存在明顯差異。在通過熔解曲線檢測突變或進行單核苷酸多態(tài)性分析時，這種影響會導致無法成功區(qū)分突變基因或誤判突變基因。

因此，對定量PCR儀更加全面科學的校準方式是采用可溯源物理手段同時對熒光定量PCR儀的溫度部分和光學部分進行校準，并分析二者之間的聯(lián)系，以保障實驗結果的準確性。

２，定量PCR儀光學校準系統(tǒng)

基于上述定量PCR儀校準需求，本文采用Cyclertest3Doptical定量PCR儀光學校準系統(tǒng)對定量PCR儀的溫場和熒光系統(tǒng)進行全面校準。系統(tǒng)在原有的PCR儀溫度校準系統(tǒng)基礎上運用可溯源光譜理論，將溫度和熒光檢測相結合，模擬定量PCR儀試驗，不僅可以對溫度模塊、上蓋溫度進行檢測，還能同時對熒光系統(tǒng)進行檢測，并分析而二者的相關性，更準確地確定定量PCR儀誤差及誤差來源。

前端傳感器示意圖檢測系統(tǒng)鑲嵌經校準并可用光譜儀溯源的發(fā)光LEG，通過給定電流量的不同會產生不同區(qū)強度的熒光模擬標準熒光激發(fā)，并通過對熒光激發(fā)部分的溫度控制。

這種設計避免了光譜的漂移，保證LEG的激發(fā)光在運行過程中保持絕對的同一水平，這種采用物理手段進行檢測，避免了人為操作引入的誤差，更加準確。這種熒光檢測方法通過了國際認證，運用了可溯源光譜理論，可溯源溫度計量來對熒光定量PCR進行*的檢測，系統(tǒng)根據溯源性、可靠性和準確性。

系統(tǒng)溫度部分可以對定量PCR儀的溫度準確度、孔間溫差、實時升溫速率、實時降溫速率、溫度過沖、溫度持續(xù)時間、上蓋溫度進行校準。熒光部分可以對定量PCR儀的Ｃｑ（Ｃｔ）相差值、精確度、熒光飽和值、熒光線性、熔解曲線精確度及一致性，熔解溫度的比例關系及線性靈敏度等進行檢測。

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